PVDF膜和NC膜作為Western印跡應(yīng)用中最常用的兩種類型的膜，各有什么特點(diǎn)？我們該如何選擇？
印跡所使用的膜的類型可能影響下列因素：
•蛋白質(zhì)結(jié)合能力
•是否需要用醇預(yù)濕
•開展多次剝離(stripping)和再生檢測(reprobing)實(shí)驗(yàn)的能力
•蛋白質(zhì)觀察
•長期印跡保存
•信噪比
聚偏二氟乙烯(PVDF)和硝酸纖維素是Western印跡應(yīng)用中最常用的兩種類型的膜。
與硝酸纖維素膜相比，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上有許多優(yōu)點(diǎn)。PVDF膜可提供更好的蛋白質(zhì)截留率、物理強(qiáng)度和廣泛的化學(xué)兼容性(Pluskal等，1986)。其中更高的機(jī)械強(qiáng)度和出色的耐化學(xué)性讓PVDF膜成為免疫檢測中各種染色應(yīng)用和二次檢測的理想選擇。使用PVDF膜的另一個優(yōu)點(diǎn)是，單塊凝膠上的平行重復(fù)泳道可用于各種應(yīng)用中，如考馬斯藍(lán)染色，接著切割條帶進(jìn)行N端測序，蛋白質(zhì)水解/肽段分離/內(nèi)部測序，以及免疫檢測(Kurien等，2003)。市售的硝酸纖維素膜的典型結(jié)合能力是80 – 100 μg/cm2，而PVDF膜的結(jié)合能力是100 – 200 μg/cm2。
在檢測血清中人免疫缺陷病毒(HIV)時直接比較PVDF和硝酸纖維素膜，結(jié)果表明，PVDF膜有著更好的總體HIV抗原截留率，并且有助于改善提高抗體對糖基化包膜抗原的檢測(Lauritzen和 Pluskal，1998)。硝酸纖維素膜和PVDF膜的特性比較詳見表1。
表1. PVDF和硝酸纖維素膜特性及應(yīng)用的比較
| 特性/應(yīng)用 | 硝酸纖維素 | PVDF |
| 物理強(qiáng)度 | 差 | 好 |
| 蛋白質(zhì)結(jié)合能力 | 80 – 100 μg/cm2 | 100 – 300 μg/cm2 |
| 耐溶劑性 | 否 | 是 |
| Western轉(zhuǎn)移 | 是 | 是 |
| 總蛋白染料 | 膠體金 | 膠體金 |
| 麗春紅 | 麗春紅 | |
| 氨基黑 | 氨基黑 | |
| 印度墨汁 | 印度墨汁 | |
| Sypro®印跡染料 | 考馬斯藍(lán)染料 | |
| 檢測 | 顯色 | 顯色 |
| 化學(xué)發(fā)光 | 化學(xué)發(fā)光 | |
| 熒光 | 熒光 | |
| 放射性 | 化學(xué)熒光 | |
| 放射性 | ||
| 雙印跡方法 | 否 | 是 |
| 快速免疫檢測 | 否 | 是 |
| Western再次雜交 | 是 | 是 |
| Edman測序 | 否 | 是 |
| 氨基酸分析 | 是 | 是 |
| SDS存在下的結(jié)合 | 差 | 好 |
| 膜上消化或質(zhì)譜分析 | 否 | 是 |
| 直接MALDI-TOF MS分析 | 否 | 是 |
| 數(shù)據(jù)可存檔 | 否 | 是 |
默克密理博提供四種PVDF膜：
• Immobilon®-P膜(0.45 μm)是一種通用的基質(zhì)，適用于一般的免疫印跡應(yīng)用。
• Immobilon®-PSQ膜(0.2 μm)適用于蛋白質(zhì)測序和低分子量蛋白的免疫印跡。它有著更高的蛋白質(zhì)結(jié)合能力以及比0.45 μm膜更高的截留率。
• Immobilon®-FL膜(0.45 μm)是為熒光免疫檢測而開發(fā)的。它在多種激發(fā)和發(fā)射波長范圍內(nèi)的熒光背景都極低。
• Immobilon®-E膜(0.45 μm)是第一個用于蛋白質(zhì)印跡的PVDF膜，可以用水性轉(zhuǎn)移緩沖液潤濕。這省去了其他PVDF膜所需的酒精預(yù)濕步驟。
Immobilon®轉(zhuǎn)印膜以卷膜和方片膜形式提供。預(yù)切好的膜與所有預(yù)制膠以及大部分市售的凝膠電泳系統(tǒng)兼容。Immobilon®轉(zhuǎn)印膜的性質(zhì)詳見表2。表3列出了與最常用的電泳系統(tǒng)相匹配的Immobilon®預(yù)切膜的尺寸。表4列出了與現(xiàn)有的預(yù)制膠相匹配的Immobilon®預(yù)切膜的尺寸。
表2. Immobilon® PVDF轉(zhuǎn)印膜的性質(zhì)和應(yīng)用
| Immobilon®-P轉(zhuǎn)印膜 | Immobilon®-PSQ轉(zhuǎn)印膜 | Immobilon®-FL轉(zhuǎn)印膜 | Immobilon®-E PVDF膜 | |
| 描述 | 為結(jié)合從各種凝膠基質(zhì)上轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)而優(yōu)化 | 均一的孔徑結(jié)構(gòu)帶來分子量<20 kDa的蛋白質(zhì)的出色結(jié)合 | 為熒光免疫檢測應(yīng)用而優(yōu)化 | 首個用于蛋白質(zhì)印跡的PVDF膜，可以用水性轉(zhuǎn)移緩沖液潤濕 |
| 組成 | PVDF | PVDF | PVDF | PVDF |
| 孔徑大小 | 0.45 μm | 0.2 μm | 0.45 μm | 0.45 μm |
| 疏水性 | 疏水 | 疏水 | 疏水 | 疏水 |
| 應(yīng)用 | Western印跡 | 低分子量 | Western印跡 | Western印跡 |
| 結(jié)合分析 | Western印跡 | 斑點(diǎn)/狹縫印跡 | ||
| 氨基酸分析 | 氨基酸分析 | 熒光免疫檢測 | ||
| N端蛋白測序 | 質(zhì)譜分析 | |||
| 斑點(diǎn)/狹縫印跡 | N端蛋白測序 | |||
| 糖蛋白觀察 | ||||
| 脂多糖分析 | ||||
| 質(zhì)譜分析 | ||||
| 檢測方法 | 顯色 | 顯色 | 熒光 | 化學(xué)發(fā)光 |
| 化學(xué)熒光 | 熒光 | 顯色 | 顯色 | |
| 化學(xué)發(fā)光 | 化學(xué)熒光 | 化學(xué)熒光 | 放射性 | |
| 放射性 | 化學(xué)發(fā)光 | 化學(xué)發(fā)光 | ||
| 放射性 | ||||
| 蛋白質(zhì)結(jié)合能力 | 胰島素：160 μg/cm2 | 胰島素：262 μg/cm2 | 胰島素：155 μg/cm2 | 胰島素：160 μg/cm2 |
| BSA：215 μg/cm2 | BSA：340 μg/cm2 | BSA：205 μg/cm2 | BSA：215 μg/cm2 | |
| 山羊IgG：294 μg/cm2 | 山羊IgG：448 μg/cm2 | 山羊IgG：300 μg/cm2 | 山羊IgG：294 μg/cm2 | |
| 兼容的可逆染料 | 透射法 | 透射法 | 透射法 | 透射法 |
| 麗春紅 | 麗春紅 | 麗春紅 | 麗春紅 | |
| CPTS | CPTS | CPTS | Sypro® ruby | |
| 甲苯胺藍(lán) | 甲苯胺藍(lán) | Sypro印跡染料 | ||
| Sypro®印跡染料 | Sypro印跡染料 | |||
| 兼容的不可逆染料 | 考馬斯亮藍(lán)染料 | 考馬斯亮藍(lán)染料 | 考馬斯亮藍(lán)染料 | 考馬斯亮藍(lán) |
| 氨基黑 | 氨基黑 | 氨基黑 | 氨基黑 | |
| 印度墨汁 | 印度墨汁 | 印度墨汁 | ||
| 膠體金 | 膠體金 | 膠體金 |
表3. Immobilon® PVDF預(yù)切轉(zhuǎn)印膜和匹配的電泳系統(tǒng)
| Manufacturer | Vertical Gel Box | Gel size(cm) | Immobilon® Size (cm) | Immobilon® NOW format compatible | Immobilon®-P 0.45 μm | Immobilon®-PSQ 0.2 μm | Immobilon®-FL 0.45 μm* | Immobilon®-E 0.45 μm |
| GE Healthcare | SE 250 Mighty Small™ | 8 × 7 | 8.4 × 7 | ■ | IPVH07850 | ISEQ07850 | IPFL07810 | IEVH07850 |
| SE 260 Mighty Small™ | 8 × 9.5 | 8 × 10 | IPVH08100 | ISEQ08100 | IEVH08100 | |||
| miniVE | 8 × 9.5 | 8 × 10 | IPVH08100 | ISEQ08100 | IEVH08100 | |||
| 8.5 × 10 | 10 × 10 | IPVH10100 | ISEQ10100 | IPFL10100 | ||||
| SE 400 | 14 × 16 | 15 × 15 | IPVH15150 | ISEQ15150 | ||||
| SE 600 | 14 × 16 | 15 × 15 | IPVH15150 | ISEQ15150 | ||||
| 14 × 8 | 13.5 × 8.5 | ■ | IPVH08130 | ISEQ08130 | ||||
| Bio-Rad | Mini-PROTEAN® 3 Dodeca™ | 8.3 × 7.3 | 8.4 × 7 | ■ | IPVH07850 | ISEQ07850 | IPFL07810 | IEVH07850 |
| Criterion™, Criterion™ Dodeca™ | 13.3 × 8.7 | 13.5 × 8.5 | ■ | IPVH08130 | ISEQ08130 | |||
| PROTEAN® II xi | 16 × 16 | 15 × 15 | IPVH15150 | ISEQ15150 | ||||
| 16 × 20 | 26.5 × 375 | IPVH00010 | ISEQ00010 | IPFL00010 | ||||
| PROTEAN® II XL | 19.3 × 18.3 | 20 × 20 | IPVH20200 | ISEQ20200 | IPFL20200 | |||
| PROTEAN® Plus Dodeca™ | 20 × 20.5 | 26 × 26 | ISEQ304F0 | ISEQ304F0 | ||||
| Mini-PROTEAN® Tetra | 8.3 × 7.3 | 8.4 × 7 | ■ | IPVH07850 | ISEQ07850 | IPFL07810 | IEVH07850 | |
| Invitrogen | XCell SureLock™ Mini-Cell | 8 × 8 | 8.4 × 7 | ■ | IPVH07850 | ISEQ07850 | IPFL07810 | IEVH07850 |
| XCell4 SureLock™ Midi | 8 × 13 | 8.5 × 13.5 | ■ | IPVH08130 | ISEQ08130 | |||
| Thermo Scientific | Owl® P81, P82, P8DS | 10 × 10 | 10 × 10 | IPVH10100 | ISEQ10100 | IPFL10100 | ||
| Owl® P82, P8DS | 8 × 10 | 8 × 10 | IPVH08100 | ISEQ08100 | IEVH08100 | |||
| Owl® P9DS | 16 × 16 | 15 × 15 | IPVH15150 | ISEQ15150 | ||||
| Owl® P10PS | 20 × 20.5 | 20 × 20 | IPVH20200 | ISEQ20200 | IPFL20200 |
表4. Immobilon® PVDF預(yù)切轉(zhuǎn)印膜和匹配的預(yù)制膠
| Manufacturer | Vertical Gel Box | Gel size(cm) | Immobilon® Size (cm) | Immobilon® NOW format compatible | Immobilon®-P 0.45 μm | Immobilon®-PSQ 0.2 μm | Immobilon®-FL 0.45 μm* | Immobilon®-E 0.45 μm |
| Bio-Rad | Mini-PROTEAN™ TGX, Mini-PROTEAN™ TGX Stain-Free | 8.6 × 6.8 | 8.4 × 7 | ■ | IPVH07850 | ISEQ07850 | IPFL07810 | |
| Criterion™ TGX, Criterion™ TGX Stain-Free, Criterion™ Tris-HCl, Criterion™ Stain-Free Tris-HCl, Criterion™ XT Bis-Tris | 13.3 × 8.7 | 13.5 × 8.5 | ■ | IPVH08130 | ISEQ08130 | |||
| Lonza | PAGEr® Gold | 9 × 10 | 8 × 10 | ■ | IPVH08100 | ISEQ08100 | IEVH08100 | |
| 10 × 10 | 10 × 10 | IPVH10100 | ISEQ10100 | IPFL10100 | ||||
| NuSep | nUView Tris-Glycine, Stain Free | 8.6 × 6.8 | 8.4 × 7 | IPVH08100 | ISEQ08100 | IPFL07810 | IEVH07850 | |
| 8 × 8 | 8 × 10 | IPVH08100 | ISEQ08100 | IEVH08100 | ||||
| Invitrogen | NuPAGE® , Bolt® | 8 × 8 | 8.4 × 7 | ■ | IPVH07850 | ISEQ07850 | IPFL07810 | IEVH07850 |
| Novex® | 8 × 8 | 8.4 × 7 | ■ | IPVH07850 | ISEQ07850 | IPFL07810 | IEVH07850 | |
| E-PAGE | 13.5 × 10.8 | 13.5 × 8.5 | ■ | IPVH08130 | ISEQ08130 | |||
| Expedeon | RunBlue™ TEO-Tricine SDS | 8 × 10 | 8 × 10 | IPVH08100 | ISEQ08100 | IEVH08100 | ||
| RunBlue™ Tris-Bis | 10 × 10 | 10 × 10 | IPVH10100 | ISEQ10100 | IPFL10100 | |||
| Genscript | ExpressPlus™ | 8 × 10 | 8 × 10 | IPVH08100 | ISEQ08100 | IPFL10100 | IEVH08100 | |
| SurePAGE™ | 8.6 × 6.8 | 8.4 × 7 | ■ | IPVH07850 | ISEQ07850 | IPFL07810 | IEVH07850 | |
| Millipore Sigma | mPAGE™ | 8.6 × 6.8 | 8.4 × 7 | ■ | IPVH07850 | ISEQ07850 | IPFL07810 | IEVH07850 |
